PCR-RFLP no Diagnóstico de Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii é um coccídeo intracelular obrigatório, formador de cistos teciduais, responsável pela zoonose cosmopolita toxoplasmose e descrito como o parasito mais frequentemente diagnosticado em todo mundo. Humanos e animais homeotérmicos, incluindo animais domésticos e silvestres são considerados hospedeiros intermediários. No entanto, os felídeos são os únicos considerados como hospedeiros definitivos. Com relação às características moleculares, foi descrito o tamanho do genoma do T. gondii com 63,0 Mb, 14 cromossomos, 7286 proteínas que codificam genes e 28,3% de proteínas codificadoras de genoma.
A análise de RFLP vem sendo utilizada para o estudo de diferentes protozoários como Trypanosoma, Plasmodium, Naegleria e Acanthamoeba, e helmintos como Schistosoma, Acantamoeba e Taenia. Essa técnica é baseada na capacidade de endonucleases de restrição em reconhecer polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), digerir produtos de PCR e, posteriormente, exibir padrões de bandas distintos na eletroforese. Sinteticamente, cada enzima de restrição reconhece uma sequência específica de quatro, seis ou oito bases; havendo a mudança de uma única base dentro dessa sequência, a enzima não clivará o DNA. Clivando-se duas moléculas de DNA relacionadas, contudo diferentes, com a mesma enzima de restrição, pode obter-se segmentos de comprimentos diferentes, que os separando com gel, originam bandas de diferentes pesos moleculares.
O desenvolvimento das técnicas de PCR tornou possível amplificar locus genéticos específicos para análise de RFLP, através de um número pequeno de células, tornando a técnica mais simples, bem como possibilitou a análise direta de amostras sem a necessidade de cultivos prolongados dos isolados, e uma possível alteração da amostra fora do seu hospedeiro original. Essa técnica detecta variações mínimas em um único gene, sendo amplamente utilizada. Visando demonstrar os benefícios da PCR-RFLP, comparações com outras técnicas de genotipagem revelaram que essa necessita de uma baixa quantidade de DNA necessária, ótima qualidade de DNA, uma boa reprodutibilidade e uma boa informatividade por loco. Além disso, a técnica em RFLP é vantajosa por não necessitar de muitos utensílios avançados, apenas um termociclador e equipamentos de eletroforese.
O uso de métodos de caracterização molecular de T. gondii através de marcadores com maior grau de polimorfismo vem indicando a existência de linhagens recombinantes. Em prol do grande potencial zoonótico da toxoplasmose é altamente relevante a investigação genotípica proveniente de infecções em animais e de genótipos de produtos de origem animal, seja para analisar a relação entre o genótipo e as propriedades biológicas ou para o rastreamento epidemiológico do agente para identificação de vias de transmissão e fatores de risco.
